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REVISTA CICPC
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de un incremento drástico en la sensibilidad de
los ensayos de biología molecular, y ello vino
a facilitar la investigación del ADN a partir de
cantidades mucho más pequeñas que las que
anteriormente se necesitaban. Según Gon-
zález (2006), la cantidad que actualmente se
requiere de ADN para llevar a cabo una PCR
es de 250 pg/ml y se debe acotar que el éxito
del análisis es mayor cuando los fragmentos
de marcadores de ADN que se utilizan para el
estudio son más cortos.
Un aumento en la concentración de for-
maldehído en los tejidos favorece las reac-
ciones que impiden la extracción del ADN,
pudiendo llegar incluso a degradar al mismo
(Srinivasan, Sedmak y Jewell, 2002). El gru-
po aldehído se puede combinar con el nitró-
geno y algunos otros átomos de las proteínas
si están muy próximos entre sí, formando un
enlace cruzado denominado puente de meti-
leno o “Crosslinking”, (Feldman, 1973). Al re-
mover los átomos de hidrógeno de la molécula
proteínica durante la reacción formaldehído-
proteína, ésta se hace más resistente al ca-
lor, enzimas, químicos y álcalis haciendo más
difícil la extracción del ADN. Sustancias como
los carbohidratos, lípidos y ácidos nucleícos
pueden ser atrapados en la matriz de proteí-
nas quedando insolubilizados, pero no están
químicamente modificados por el formaldehí-
do a menos que la fijación se prolongue du-
rante varias semanas o se rompa esta matriz.
Para llevar a cabo la Extracción de ADN
de Tejidos fijados en formol, es necesario di-
gerir las proteínas que forman los puentes
cruzados (Crosslinks) con el ADN, mediante el
empleo de enzimas especificas como la Pro-
teínasa K. Ver figura 2.
El formol también hidroliza los enla-
ces fosfodiester del ADN (Douglas y Rogers,
1998), disminuyendo la cantidad y calidad del
ADN obtenido mediante diferentes técnicas
de extracción. La presencia de sustancias de
naturaleza ácida, como el ácido fórmico con-
tenido en la formalina también contribuye a la
desnaturalización de las proteínas y el ADN. El
ácido fórmico se añade para aumentar la fuer-
za fijadora y acelerar la velocidad de fijación
de la formalina. Del mismo modo, la hipoxia
prolongada del tejido reduce el pH y disminuye
el rendimiento en la extracción de los ácidos
nucleícos (Tokuda y cols.,1990).
El formaldehído penetra al tejido rápida-
mente, pero las reacciones con las proteínas,
especialmente los enlaces químicos, ocurren
lentamente. Uno de los enlaces más resisten-
tes y duraderos que forma el formaldehído es
cuando interactúa con el aminoácido lisina, en
donde se entrelaza y forma un puente bastan-
te resistente al unirse con uno de los termina-
les de éste aminoácido y en el otro extremo a
un átomo de nitrógeno de un enlace péptidico
(Walker, 1964), los demás tipos de enlaces
parecen ser reversibles, y ésta es una de las
grandes ventajas que hace viable la extracción
de ADN a partir de TCFF.
Las soluciones de formalina se degradan
con el tiempo si no son estabilizadas. El agen-
te estabilizador más usado es el metanol en
concentraciones de un 3-8% en la solución.
Los estabilizadores son muy importantes por-
que la formalina que permanece almacenada
por largos periodos se degrada (convierte en
metilen glicol) y se oxida cambiando el pH.
Si la degradación no se detiene a tiempo se
convierte en una solución alcalina y pierde su
Fig 2: Efecto del formaldehido; el formaldehído dificulta la extracción del ADN al crear enlaces cruzados (crosslinks) entre las proteínas y los ácidos nucleícos.
efectividad por completo (Walker, 1964).
El formaldehído, cuando se disuelve
en agua, se convierte en metilen glicol (Fox,
1985). La formación de este derivado era co-
nocido en la antigüedad por Blum. El equilibrio
entre el metilen glicol y el formaldehído en so-
lución acuosa favorece al metilen glicol, y éste
no tiene acción fijadora. Cuando los tejidos se
sumergen en las soluciones de formaldehído,
son penetradas más rápidamente por el meti-
len glicol, por ello los embalsamadores estabi-
lizan las soluciones añadiendo metanol, esta
propiedad puede ser usada para transformar
el formol presente en la solución fijadora.
CONCLUSIONES
• El aumento en la concentración de formal-
dehído favorece las reacciones que impi-
den la extracción del ADN pudiendo llegar
incluso a degradar al mismo.
• El grupo aldehído se puede combinar con
el nitrógeno y algunos otros átomos de las
proteínas, formando un enlace cruzado
denominado puente de metileno o “Cross-
linkanged”, (Feldman, 1973).
• Las soluciones de formalina se degradan
con el tiempo si no son estabilizadas. La
formalina que permanece almacenada por
largos periodos se degrada (convierte en
metilen glicol) y se oxida cambiando el pH.
Si la degradación no se detiene a tiempo se
convierte en una solución alcalina y pierde
su efectividad por completo (Walker, 1964).
• El formol también hidroliza los enlaces
fosfodiester del ADN (Douglas y Rogers,
1998).
• Para llevar a cabo la extracción de ADN
desde tejidos fijados en formol, es nece-
sario ajustar las condiciones del pH y la
temperatura en el medio, para desfavore-
cer la interacción del formaldehido con el
ADN, digerir las proteínas que forman los
puentes cruzados (Crosslinks), mediante
el empleo de enzimas especificas como la
Proteínasa K, llevar a cabo lavados y reac-
ciones químicas que remuevan o trans-
formen el formaldehido en productos no
afecten la estructura del ADN, y por último
emplear métodos de purificación a los áci-
dos nucleícos obtenidos
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